Реферат: Введение мышам ДНК плазмиды pcDNA- 3S, содержащей ген нуклеокапсидного белка вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом вызывает иммунный ответ

Med-books.by - Библиотека медицинской литературы. Книги, справочники, лекции, аудиокниги по медицине. Банк рефератов. Медицинские рефераты. Всё для студента-медика.
Скачать бесплатно без регистрации или купить электронные и печатные бумажные медицинские книги (DJVU, PDF, DOC, CHM, FB2, TXT), истории болезней, рефераты, монографии, лекции, презентации по медицине.


=> Книги / Медицинская литература: Акупунктура | Акушерство | Аллергология и иммунология | Анатомия человека | Английский язык | Анестезиология и реаниматология | Антропология | БиоХимия | Валеология | Ветеринария | Внутренние болезни (Терапия) | Военная медицина | Гастроэнтерология | Гематология | Генетика | География | Геронтология и гериатрия | Гигиена | Гинекология | Гистология, Цитология, Эмбриология | Гомеопатия | ДерматоВенерология | Диагностика / Методы исследования | Диетология | Инфекционные болезни | История медицины | Йога | Кардиология | Книги о здоровье | Косметология | Латинский язык | Логопедия | Массаж | Математика | Медицина Экстремальных Ситуаций | Медицинская биология | Медицинская информатика | Медицинская статистика | Медицинская этика | Медицинские приборы и аппараты | Медицинское материаловедение | Микробиология | Наркология | Неврология и нейрохирургия | Нефрология | Нормальная физиология | Общий уход | О достижении успеха в жизни | ОЗЗ | Онкология | Оториноларингология | Офтальмология | Паллиативная медицина | Паразитология | Патологическая анатомия | Патологическая физиология | Педиатрия | Поликлиническая терапия | Пропедевтика внутренних болезней | Профессиональные болезни | Психиатрия-Психология | Пульмонология | Ревматология | Сестринское дело | Социальная медицина | Спортивная медицина | Стоматология | Судебная медицина | Тибетская медицина | Топографическая анатомия и оперативная хирургия | Травматология и ортопедия | Ультразвуковая диагностика (УЗИ) | Урология | Фармакология | Физика | Физиотерапия | Физическая культура | Философия | Фтизиатрия | Химия | Хирургия | Экологическая медицина | Экономическая теория | Эндокринология | Эпидемиология | Ядерная медицина

=> Истории болезней: Акушерство | Аллергология и иммунология | Ангиология | Внутренние болезни (Терапия) | Гастроэнтерология | Гематология | Гинекология | ДерматоВенерология | Инфекционные болезни | Кардиология | Наркология | Неврология | Нефрология | Онкология | Оториноларингология | Офтальмология | Педиатрия | Профессиональные болезни | Психиатрия | Пульмонология | Ревматология | Стоматология | Судебная медицина | Травматология и ортопедия | Урология | Фтизиатрия | Хирургия | Эндокринология

=> Рефераты / Лекции: Акушерство | Аллергология и иммунология | Анатомия человека | Анестезиология и реаниматология | Биология | Биохимия | Валеология | Ветеринария | Внутренние болезни (Терапия) | Гастроэнтерология | Гематология | Генетика | Гигиена | Гинекология | Гистология, Цитология, Эмбриология | Диагностика | ДерматоВенерология | Инфекционные болезни | История медицины | Лечебная физкультура / Физическая культура | Кардиология | Массаж | Медицинская реабилитация | Микробиология | Наркология | Неврология | Нефрология | Нормальная физиология | Общий уход / Сестринское дело | Озз | Онкология | Оториноларингология | Офтальмология | Патологическая анатомия | Педиатрия | ПатоФизиология | Профессиональные болезни | Психиатрия-Психология | Пульмонология | Ревматология | Скорая и неотложная медицинская помощь | Стоматология | Судебная медицина | Токсикология | Травматология и ортопедия | Урология | Фармакогнозия | Фармакология | Фармация | Физиотерапия | Фтизиатрия | Химия | Хирургия | Эндокринология | Эпидемиология | Этика и деонтология

=> Другие разделы: Авторы | Видео | Клинические протоколы / Нормативная документация РБ | Красота и здоровье | Медицинские журналы | Медицинские статьи | Наука и техника | Новости сайта | Практические навыки | Презентации | Шпаргалки


Med-books.by - Библиотека медицинской литературы » Рефераты: Инфекционные болезни » Реферат: Введение мышам ДНК плазмиды pcDNA- 3S, содержащей ген нуклеокапсидного белка вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом вызывает иммунный ответ

Реферат: Введение мышам ДНК плазмиды pcDNA- 3S, содержащей ген нуклеокапсидного белка вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом вызывает иммунный ответ

-1

Скачать бесплатно реферат:
«Введение мышам ДНК плазмиды pcDNA- 3S, содержащей ген нуклеокапсидного белка вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом вызывает иммунный ответ»


Для Республики Башкортостан весьма актуальной является проблема геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Возбудителем данного заболевания в Башкирии является хантавирус серотипа Puumala (PUU), который переносится преимущественно рыжей полевкой Clethrionomysglariolus.
Ежегодно в республике фиксируется до нескольких тысяч случаев заболеваний ГЛПС, нередки летальные исходы (Фазлыева Р. и др., 1995). К сожалению, на сегодняшний день не получены эффективные лекарственные препараты для профилактики и лечения ГЛПС. Поэтому, особенно важным для нашего региона является проблема разработки соответствующих профилактических и лечебных средств, адаптированных к российским штаммам возбудителям этого заболевания.
ДНК-вакцины представляют собой сравнительно новый тип вакцин, принцип применения которых состоит в том, что в организм пациента вводят ДНК, содержащую ген, кодирующий белок патогена, к которому необходимо получить иммунный ответ. Данный метод уже позволил получить полноценный (гуморальный и клеточный) иммунный ответ к огромному количеству патогенных микроорганизмов (Ivoryetal., 2004).
Целью нашей работы являлось создание на основе эукариотического вектора pcDNA-3 плазмидной конструкции, содержащей ген нуклеокапсидного (N) белка вируса ГЛПС и исследование возможного иммунного ответа, индуцированного инъекцией ДНК данной конструкции в мышечную ткань мышей.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования был избран клонированный фрагмент генома хантавируса серотипа PUU, кодирующий полноразмерный N белок, выделенный из больных, погибших от ГЛПС во время вспышки 1997-1988 г.г. в г. Уфа. В опытах по ДНК-иммунизации использовали нелинейных белых мышей весом 18-20 г в возрасте 8-10 недель.
Для создания генетической конструкции, использованной для иммунизации мышей, применяли стандартные методики (Sambrooketal., 1989). Генную иммунизацию проводили по следующей схеме. Плазмидную ДНК, выделенную и очищенную по стандартной методике, вводили мышам в физиологическом растворе по 100 мкл в концентрации 2 мкг/мл в квадратичную мышцу 3 раза с интервалом в три недели, кровь брали на 0, 3, 6, и 9 неделях опыта. На 10 неделе из мышечной ткани из места инъекции выделили геномную ДНК по методике описанной Д. Мерфи и Дж. Хэнсоном (Гловер и др., 1989). Амплификацию геномной ДНК проводили на многоканальном амплификаторе МС-2 (АО "ДНК-Технология", Москва) в течение 40 циклов при температуре отжига 42°C. Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили по методике, изложенной в лабораторном руководстве Гловера с соавт. (Гловер и др., 1989).
Результаты
Фрагмент генома вируса PUU длиной 1302 п.н., кодирующий полноразмерный N вирусный белок, мы переклонировали из созданной нами ранее плазмиды pGEM-TEasyS в вектор для транзиентной экспрессии pcDNA-3 по сайтам для рестриктазы EcoRI. После рестриктазного картирования и секвенирования был отобран клон pcDNA-3S с правильной ориентацией вставки относительно CMV промотора. Полученная конструкция pcDNA-3S отвечает требованиям, предъявляемым для успешной ДНК-вакцинации (Smookeretal., 2004). Вектор pcDNA-3 содержит промотор цитомегаловируса, который обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного гена в эукариотических клетках, а также сигнал полиаденилирования. Для наработки плазмиды в E. сoli в вектор включен прокариотический origin репликации. Кроме того, клонированная последовательность S-сегмента содержит инициирующий ATG и терминирующий TGA триплеты. Плазмидная ДНК данного клона далее была использована нами для иммунизации лабораторных мышей. В качестве контроля использовали вектор pcDNA-3, который вводили по той же схеме, что и pcDNA-3S. Сыворотка всех иммунизированных животных, собранная до начала эксперимента, а также через одну неделю после каждой инъекции была тестирована с помощью непрямого ИФА на присутствие антител к белку N хантавируса.
эукариотический вектор вирус лихорадка
Таблица 1. Гуморальный ответ мышей, иммунизированных плазмидами pcDNA-3 (контроль) и pcDNA-3S, содержащей последовательность, кодирующую N белок вируса PUU
№ животного Введенная плазмида Оптическая плотность, О.Е.
Сыворотка д. и.* Сыворотка 3 неделя п.п.и. Сыворотка 6 неделя п.п.и. Сыворотка 9 неделя п.п.и
1 pcDNA-3 0,641 0,484 0,364 0,298
2 pcDNA-3S 0,382 1,481 1,820 0,296
3 pcDNA-3S 0,275 2,127 1,593 0,751
4 pcDNA-3S 0,251 2,068 1,173 0,767
5 pcDNA-3S 0,370 2,116 0,883 1,944
6 pcDNA-3S 0,121 0,863 1,645 0,247
7 pcDNA-3S 0,685 1,08 0,752 0,718
8 pcDNA-3S 0,274 2,01 0,156 0,862
9 pcDNA-3S 0,413 1,483 1,503 1,616

Данные ИФА показали, что внутримышечное введение экспрессирующего вектора pcDNA-3S, кодирующего ген белка N, вызывало у большинства иммунизированных животных повышение уровня иммуноглобулинов, что, видимо, связано с синтезом N-антител (табл.1). Наибольший уровень антител, по сравнению с контролем, был зафиксирован нами в сыворотке опытных животных, взятой на 3 и 6 неделях эксперимента. В дальнейшем происходило некоторое снижение уровня антител, но, у большинства мышей конечный уровень N-антител после третьей инъекции значительно превышал исходный. У контрольного животного, иммунизированного исходным плазмидным вектором pcDNA-3, подобная динамика не наблюдалась. К сожалению, причина отсутствия вышеуказанной динамики у части иммунизированных животных не ясна.
Методом ПЦР было показано присутствие плазмиды pcDNA-3S в мышечной ткани иммунизированных мышей. Амплификация геномной ДНК, выделенной из сайта инъекции с праймером, соответствующем участку с 39 по 59 н. "+" цепи кДНК S-сегмента штамма CG-1820/Уфа-83 (ориентация "+") и праймером, комплементарным участку с 552 по 576 н. "+" цепи кДНК S-сегмента штамма CG-1820/Уфа-83, (ориентация "-") выявила фрагмент, размер которого совпал с ожидаемым и составил 537 п.н. (рис.1)

Рис.1. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР: 1-маркерные фрагменты ДНК фага λ, расщепленные рестриктазой StyI; 2-амплификация геномной ДНК мыши, иммунизированной pcDNA 3; 3, 4, 5, 6-амплификация геномной ДНК мышей, иммунизированных pcDNA 3S

Таким образом, мы предполагаем, что иммунизация мышей плазмидной конструкцией pcDNA-3S, содержащей последовательность, кодирующую белок N вируса серотипа PUU, под контролем CMV промотора, индуцирует эндогенный синтез антител против данного антигена. Различия в динамике N-антител связаны, вероятнее всего, с индивидуальными особенностями иммунной системы мышей, поскольку нами использовались нелинейные мыши. Также полученные нами результаты свидетельствуют, что плазмида pcDNA-3S присутствовала в мышечной ткани иммунизированных животных, по крайней мере, в течение месяца после последней инъекции.
Роль белка N в индукции защитного иммунитета против хантавирусов, вызывающих ГЛПС, остается плохо изученной. Ранее проведенные исследования показали, что N-антитела не обладают нейтрализующей активностью (Hooperetal., 1999). Однако в ряде работ сообщалось, что иммунизация мышей рекомбинантным хантавирусным N белком, а также ДНК-вакцинация животных экспрессирующими векторами, несущими ген белка N патогенных хантавирусов защищало мышей в некоторых случаях от дальнейшего заражения ГЛПС (Ulrich etal., 1998; Buchtetal., 2001; Bharadwajetal., 2002). Поэтому, возможно, что белок N играет важную роль в индукции клеточного иммунитета против инфекции, вызываемой хантавирусами.
Таким образом, в дальнейшем необходимо провести новые долгосрочные эксперименты с целью определить, способна ли полученная нами конструкция вызвать долговременный иммунный ответ в животных, а также защитить их от инфицирования хантавирусом серотипа PUU.

Список литературы

.Ivory C., Chadee K. DNA vaccines: designing strategies against parasitic infections // Gen.vaccines and therapy. - 2004. - V. 2 - P.17-45.
.Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning A laboratory manual, 2nd edn. - 1989. - Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Gold Spring Harbor.
3.Гловер. Д. Новое в клонировании ДНК. Методы. М.: Мир, 1989. С. 346.
.Фазлыева Р.М., Хунафина Д.Х., Камилов Ф.Х. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом в республике Башкортостан. У. 1995. С. 243.
.Smooker P., Rainczuk A., Kennedy N., Spithill T. DNA vaccines and their application against parasites-promise, limitations and potential solutions. 2004. - V.10. - P.189-236.
.Ulrich R., Lundkvist A., Meisel H., Koletzki D., Brus-Sjolander K., Gelderblom H., Borisova G., Schnitzler P., Darai G., Kruger D. Chimaeric HBC core particles carrying a defined segment of Puumala hantavirus nucleocapsid protein evoke protective immunity in an animal model // Vaccine. - 1998. -V. 16. - P. 272-280.
.Bucht G., Sjolander K., Eriksson S., Lindgren L., Eigh F. Modifying the cellular transport of DNA-based vaccines alters the immune response to hantavirus nucleocapsid protein // Vaccine. -2001. -V.19. - P. 3820-3829.
.Bharadwaj M., Mirowsky K., Ye C., Botten J., Masten B., Yee J., Lyons C., Hjelle B. Genetic vaccines protect against Sin Nombre hantavirus challenge in the deer mouse (Peromyscus maniculatus) // J. of Gen. Virol. - 2002. - V. 83. - P. 1745-1751.
Похожие материалы:

Добавление комментария

Ваше Имя:
Ваш E-Mail:

Код:
Включите эту картинку для отображения кода безопасности
обновить, если не виден код
Введите код: