Med-books.by - Библиотека медицинской литературы. Книги, справочники, лекции, аудиокниги по медицине. Банк рефератов. Медицинские рефераты. Всё для студента-медика.
Скачать бесплатно без регистрации или купить электронные и печатные бумажные медицинские книги (DJVU, PDF, DOC, CHM, FB2, TXT), истории болезней, рефераты, монографии, лекции, презентации по медицине.


=> Книги / Медицинская литература: Акупунктура | Акушерство | Аллергология и иммунология | Анатомия человека | Английский язык | Анестезиология и реаниматология | Антропология | БиоХимия | Валеология | Ветеринария | Внутренние болезни (Терапия) | Военная медицина | Гастроэнтерология | Гематология | Генетика | География | Геронтология и гериатрия | Гигиена | Гинекология | Гистология, Цитология, Эмбриология | Гомеопатия | ДерматоВенерология | Диагностика / Методы исследования | Диетология | Инфекционные болезни | История медицины | Йога | Кардиология | Книги о здоровье | Косметология | Латинский язык | Логопедия | Массаж | Математика | Медицина Экстремальных Ситуаций | Медицинская биология | Медицинская информатика | Медицинская статистика | Медицинская этика | Медицинские приборы и аппараты | Медицинское материаловедение | Микробиология | Наркология | Неврология и нейрохирургия | Нефрология | Нормальная физиология | Общий уход | О достижении успеха в жизни | ОЗЗ | Онкология | Оториноларингология | Офтальмология | Паллиативная медицина | Паразитология | Патологическая анатомия | Патологическая физиология | Педиатрия | Поликлиническая терапия | Пропедевтика внутренних болезней | Профессиональные болезни | Психиатрия-Психология | Пульмонология | Ревматология | Сестринское дело | Социальная медицина | Спортивная медицина | Стоматология | Судебная медицина | Тибетская медицина | Топографическая анатомия и оперативная хирургия | Травматология и ортопедия | Ультразвуковая диагностика (УЗИ) | Урология | Фармакология | Физика | Физиотерапия | Физическая культура | Философия | Фтизиатрия | Химия | Хирургия | Экологическая медицина | Экономическая теория | Эндокринология | Эпидемиология | Ядерная медицина

=> Истории болезней: Акушерство | Аллергология и иммунология | Ангиология | Внутренние болезни (Терапия) | Гастроэнтерология | Гематология | Гинекология | ДерматоВенерология | Инфекционные болезни | Кардиология | Наркология | Неврология | Нефрология | Онкология | Оториноларингология | Офтальмология | Педиатрия | Профессиональные болезни | Психиатрия | Пульмонология | Ревматология | Стоматология | Судебная медицина | Травматология и ортопедия | Урология | Фтизиатрия | Хирургия | Эндокринология

=> Рефераты / Лекции: Акушерство | Аллергология и иммунология | Анатомия человека | Анестезиология и реаниматология | Биология | Биохимия | Валеология | Ветеринария | Внутренние болезни (Терапия) | Гастроэнтерология | Генетика | Гигиена | Гинекология | Гистология, Цитология, Эмбриология | Диагностика | ДерматоВенерология | Инфекционные болезни | История медицины | Лечебная физкультура / Физическая культура | Кардиология | Массаж | Медицинская реабилитация | Микробиология | Наркология | Неврология | Нефрология | Нормальная физиология | Общий уход / Сестринское дело | Озз | Онкология | Оториноларингология | Офтальмология | Патологическая анатомия | Педиатрия | ПатоФизиология | Профессиональные болезни | Психиатрия-Психология | Пульмонология | Ревматология | Скорая и неотложная медицинская помощь | Стоматология | Судебная медицина | Токсикология | Травматология и ортопедия | Урология | Фармакогнозия | Фармакология | Фармация | Физиотерапия | Фтизиатрия | Химия | Хирургия | Эндокринология | Эпидемиология | Этика и деонтология

=> Другие разделы: Авторы | Видео | Клинические протоколы / Нормативная документация РБ | Красота и здоровье | Медицинские журналы | Медицинские статьи | Наука и техника | Новости сайта | Практические навыки | Презентации | Шпаргалки


Med-books.by - Библиотека медицинской литературы » Рефераты: Биохимия » Реферат: Антиоксидантные свойства новых селеносодержащих веществ в зависимости от их спектральных и структурных характеристик

Реферат: Антиоксидантные свойства новых селеносодержащих веществ в зависимости от их спектральных и структурных характеристик

0

Скачать бесплатно реферат:
«Антиоксидантные свойства новых селеносодержащих веществ в зависимости от их спектральных и структурных характеристик»


ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
1. АКТИВИРОВАННЫЕ КИСЛОРОДНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ. АНТИОКСИДАНТЫ. СЕЛЕН КАК СОСТАВЛЯЮЩАЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ
1.1 АКТИВИРОВАННЫЕ КИСЛОРОДНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ
1.2 ХАРАКТЕРИСТИКА ОСНОВНЫХ ФОРМ АКМ
1.3 АНТИОКСИДАНТЫ И ИНГИБИТОРЫ
2. СЕЛЕН В АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


ВВЕДЕНИЕ

Кислород является самым распространённым химическим элементом биосферы, его соединения в состав всех живых организмов на планете. Наиболее широко представлена восстановленная форма кислорода, или вода (H2O); для высших форм жизни необычайно важен молекулярный кислород (O2), реакция восстановления которого до H2O составляет основу биоэнергетики организма человека и животных [1].
Около 90% потребляемого человеком молекулярного кислорода вовлекается в реакции окислительного фосфорилирования, вместе с тем во всех живых организмах постоянно протекают реакции с образованием активированных кислородных метаболитов (АКМ): O¯2, 1O2, H2O2, HO, OCl¯, RO2 и др. Многие из этих соединений являются радикалами, то есть имеют неспаренный электрон, поэтому часто их называют свободными радикалами. Связанные радикалы, такие как компоненты цепи транспорта электронов в митохондриях, также широко представлены в клетках, однако их локализация в определённых структурах ограничивает "свободное" взаимодействие с другими молекулами [2]. По оценке Гельмута Эстербауэра, человек за 70 лет жизни потребляет 17 000 кг кислорода; за это время в организме нарабатывается 800-1700 кг кислородных радикалов. АКМ, образующиеся в процессе нормальной жизнедеятельности животной клетки, индуцируют в ДНК около 10 000 повреждений за сутки [3]. При этом генерация АКМ, очевидно, есть не эволюционная ошибка (неудача), а, напротив, - характерный физиологический процесс, результат революционного отбора [4].
Образование АКМ, известных как прооксиданты, наблюдается во многих метаболических процессах и является обязательным атрибутом нормальной аэробной жизни. Функционирование и развитие клеток, и организма в целом, в кислородосодержащем окружении не могло бы быть возможным без существования защитных систем, основу которых составляет ферментативные и неферментативные антиоксиданты. Постоянное образование прооксидантов в живых организмах уравновешено их дезактивацией антиоксидантами, поэтому для поддержания гомеостаза необходима непрерывная регенерация антиоксидантной способности. Отсутствие или сбои этой непрерывности сопровождаются накоплением окислительных повреждений и приводят к возникновению окислительного стресса, который является составным элементом целого ряда патологических процессов и заболеваний, таких как воспаление, реперфузионное поражение тканей, бронхолёгочные заболевания, старение, канцерогенез и др. [5] [6].
Важную роль в антиоксидантной системе играет селен. Хотя сам по себе селен и не является "прямым" антиоксидантом, он принимает активнейшее участие в процессе синтеза фермента глутатионпероксидазы - мощнейшего антиоксидантного вещества, предохраняющего клеточные мембраны от разрушительного воздействия свободных радикалов. Без достаточного содержания селена этот важнейший фермент просто не будет образовываться. В качестве антиоксиданта и детоксикатора ядовитых веществ селен защищает организм от сердечных заболеваний, усиливает иммунитет, увеличивает продолжительность жизни. Действуя совместно с другими антиоксидантами - витаминами Е и С, селен помогает улучшить мыслительные способности, снижает депрессию, прогоняет усталость.

1. АКТИВИРОВАННЫЕ КИСЛОРОДНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ. АНТИОКСИДАНТЫ. СЕЛЕН КАК СОСТАВЛЯЮЩАЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ

1.1 АКТИВИРОВАННЫЕ КИСЛОРОДНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ

Общие сведения
АКМ - высокореакционные, преимущественно радикальные, кислородные соединения, образующиеся в живых организмах в результате неполного восстановления молекулярного кислорода или изменении спина одного из его электронов, находящихся на внешних орбиталях.
Применительно к биологическим системам понятия "свободные радикалы" и "АКМ" не совпадают - неспаренный электрон может быть локализован на атомах углерода, серы, азота; так, для живых организмов важное значение имеют тиильные радикалы глутатиона (GS) или радикалы мочевой кислоты с локализацией электрона на атомах Sи N. С другой стороны, такие кислородсодержащие молекулы, как перекись водорода, синглетный кислород, гипогалогениты не являются радикалами, хотя и взаимодействуют с органическими молекулами через радикальные механизмы. Чтобы объединить данные соединения в одну группу с радикалами, вводят понятие "активные формы кислорода" или "активные метаболиты кислорода", которым обозначают ферментативные продукты активации кислорода. По аналогии с активными формами кислорода иногда говорят об активных формах азота, обозначая так продукты преобразования NO-радикалов (NO, NO+, NO¯, NO2, ONOOH), активных формах галогенов (HOCl, OCl¯,HOBr, HOI), активных формах липидов (L, LO, LO2, LOOH) [5]. В биологическом плане наиболее удачно понятие "активированные кислородные метаболиты", под которым подразумевается широкий класс кислородных соединений радикальной и нерадикальной природы.
В живых организмах существуют два принципиально разных источника АКМ: радикальные окислительные реакции и металлопротеиновые ферментативные системы. В обоих случаях молекулярный кислород выступает акцептором электронов, а появление АКМ является результатом неполного восстановления молекулы O2.

1.2 ХАРАКТЕРИСТИКА ОСНОВНЫХ ФОРМ АКМ

Первоначально все радикалы, образующиеся в живом организме, было принято делить на свободные, которые легко мигрируют в водных или липидных средах, и связанные, структурно закреплённые и участвующие в цепях переноса электронов. Такое деление достаточно условно, в частности, непонятно, к свободным или связанным относятся в таком случаем убисемихинонные радикалы, которые достаточно легко перемещаются в липидных мембранах. Введённые в последующем понятия "активные формы кислорода и азота" ("reactiveoxygenandnitrogenspecies"), "активные формы хлора", "активные формы липидов" отражали желание исследователей строго определить и классифицировать весьма разнородный класс соединений, объединённых нами под общим названием активированных кислородных метаболитов (АКМ). Сегодня наиболее удачная классификация таких соединений предложена Ю.А. Владимировым, согласно которой все образующиеся в организме АКМ в зависимости от происхождения могут быть разделены на первичные, вторичные и третичные; среди причин появления чужеродных форм АКМ также можно выделить 3 основных фактора: радиация, оптические излучения и ксенобиотики [3]. Деление АКМ на природные и чужеродные оправдано с позиций их биологической значимости.
Действительно, основной функцией природных форм АКМ является регуляторная, затем защитная, в определённых ситуациях, как правило, патологических, они могут становиться токсичными и индуцировать развитие деструктивных процессов, однако такие ситуации являются исключением, а не правилом. Образующиеся при действии радиации или в процессе фотодинамической терапии чужеродные формы АКМ, также как радикалы, возникающие в процессе метаболизма ксенобиотиков, обладают выраженным цитотоксическим и деструктивным действием.

Таблица 1
Классификация АКМ, образующихся в клетках человека и животных
Природные Первичные Вторичные Третичные O2¯, H2O2, NO, CoQo¯ или CoQ10¯ OH, RO, RO2, 1O2, HOCl, HOBr Радикалы антиоксидантов
Чужеродные Радиация УФ-излучение Ксенобиотики OH, H, R R, RO, RO2, 1O2 Радикалытоксинов

Иногда в целях регуляторного воздействия применяются доноры NO; попытки усилить защитные функции организма посредством индукции образования АКМ сегодня носят достаточно экзотический характер. Первичные формы АКМ или радикалов образуются с участием специализированных молекулярных механизмов, таких как мембранные НАДФН-оксидазы (восстанавливают O2 в O2¯), NO-синтазы (продуцируют NO) или фотосенсибилизированные процессы, являющиеся основными источниками 1O2. Как правило, эти продукты ферментативного восстановления O2 или его активации, количество весьма ограничено: O2¯, H2O2, ОH, NO, 1O2. Строение и заполнение молекулярных орбиталей O2 подчиняются квантовым законам, что существенно ограничивает количество образующихся продуктов. Первичные АКМ инициируют образование в реакциях свободнорадикального окисления большего числа вторичных радикалов липидов, белков, сахаров, нуклеиновых кислот, многие из которых более токсичны [7]. Деление на первичные и вторичные АКМ или радикалы вполне оправдано, так как позволяет при патологических процессах выделить главные молекулярные механизмы генерации АКМ. Однако, как и в случае с многими другими понятиями свободнорадикальной биологии, дать строгие определения первичных, вторичных и третичных радикалов сложно, так же как сложно точно определить понятие антиоксиданта.
Биологическая роль АКМ
Общая особенность АКМ - высокая реакционная способность и малые значения времён жизни в биологических субстратах, что делает их эффективным инструментом локального действия [8]. Так, действие OH-радикала (радиус диффузии 23 Å) [9] ограничено размером средней ограниченной молекулы (например, величина молекулы пепсина - молекулярная масса 35 кДа - составляет 37 × 74 Å). Анион-радикал O2¯ и синглетный кислород обладают большим радиусом действия, сравнимым с размером клетки, однако уже на клеточном уровне их эффект строго локализован наличием высокоэффективного ферментативного антиоксиданта - супероксиддисмутаза (СОД), а также других антиоксидантов - таких, как витаминE, который инактивирует 1O2посредством физического взаимодействия на расстоянии ~ 50 Å. Сфера влияния радикалов NOраспространяется уже на определённые клеточные структуры, такие как мышечные клетки сосудов, что вызывает их релаксацию, при этом оксид азота принципиально не отличается от гормональных мессенджеров и имеет свой "рецептор" - растворимую гуанилатциклазу. Наибольшим дальнодействием, проявляющимся на тканевом и организменном уровнях, обладают продукты радикальных реакций; так, процессы ПОЛ приводят к образованию альдегидов, эпоксидов, липидных перекисей, которые ингибируют синтез ДНК и деление клеток и в то же время индуцируют развитие опухоли. По-видимому, ПОЛ и его продукты, выступая в роли "первичного медиатора" стресса или "SOS-ответа", представляют один из наиболее ранних регуляторных механизмов, который в процессе эволюции трансформировался в ферментативную эйкозаноидную регуляцию. Окисленные фосфолипиды по свойствам сходны с фактором активации тромбоцитов и могут имитировать действие цикотина на клетки непосредственно через специфический для него рецептор.
Высокая реакционная способность АКМ делает их чрезвычайно токсичными для биологических систем на всех уровнях - от молекулярно-клеточного до организменного. В конце 40-х годов толчком для широкого изучения токсических эффектов АКМ послужили исследования действия радиации на живые организмы. В настоящее время можно утверждать, что АКМ занимают ведущее место в патогенезе радиационного поражения; деструкции тканей, вызванной развитием воспалительной реакции, и связанного с хроническим воспалением опухолеобразования; постишемических, реперфузионных и гипероксических повреждений; а также целого ряда бронхолёгочных, сердечно-сосудистых и других заболеваний. Вместе с тем механизм патофизиологического действия АКМ во многих случаях не ясен, так как утверждение о патофизиологической роли АКМ обычно строится на двух косвенных аргументах: а) интенсивность продукции АКМ коррелируют с развитием патологического процесса; б) ингибиторы АКМ обладают защитным действием.
Открытие явления дыхательного "взрыва" в фагоцитах послужило началом широкого изучения микробицидного действия АКМ, их роли в защите организма. При этом ярко выявилось, что генетически обусловленные нарушения механизмов генерации АКМ (больные с хронических гранулематозом или дефицитом миелопероксидазы) или их ингибирование лекарственным препаратами приводит к снижению неспецифического иммунитета и является причиной либо гибели организма от инфекций, либо развития хронических патологий.
В последние годы выявлен широкий спектр физиологических эффектов АКМ, к которым прежде всего относятся регуляция клеточной пролиферации и тонуса сосудов, индукция транскрипции определённых генов. Показано функционирование АКМ в качестве вторичных внутриклеточных мессенджеров. Так, АКМ непосредственно участвуют в активации онкогенов c-focи с-myc, а также гена c-jun, кодирующего главную форму фактора транскрипции AP-1, в ответ на ионизирующую радиацию. O2¯и H2O2 активируют фактор транскрипции NF-кB, который вызывает экспрессию генов, кодирующих ряд цитокинов и вирусов, в том числе ВИЧ, а NOподавляет активацию NF-кB, индуцируя экспрессию ингибитора фактора транскрипции IкBαи стабилизируя его. Стимуляция НАДФН-оксидазы нейтрофилов сопровождается активацией тирозинкиназ, при этом повышение накопления фосфотирозина обусловлено не только активацией АКМ фосфорилирования тирозина, но и ингибированием дефосфорилирования. В индукции синтеза белков теплового шока, повышающих резистентность клеток к высоким температурам, радиации, токсическому действию ионов тяжёлых металлов и лекарственных препаратов, основная роль отводится перекиси водорода. Выделяемая из облучённых фоторецепторов H2O2 увеличивают длину и количество микроворсинок клеток пигментированного эпителия, что способствует более тесному контакту этих двух типов клеток и реализации антиоксидантных функций эпителия. NOи COсвязываются с гемовой частью гуанилатцитклазы и обратимо изменяют синтез цГМФ, являясь важным компонентом внутри - и внеклеточной коммуникации. NOучаствует в посттранскрипционном контроле метаболизма железа.
Таким образом, образование АКМ в организме нельзя рассматривать, как существующий, но не обязательный элемент процесса жизнедеятельности. Окислительные процессы с участием АКМ является неотъемлемым звеном существования высших форм живых организмов, негэнтропийное состояние которых поддерживается посредством снижения электронной упорядоченности молекулярного кислорода в результате его восстановления. Однако многие вопросы регуляторной функции АКМ, их взаимодействия с антиоксидантами, физиологической и патофизиологической роли сегодня всё ещё остаются спорными.

1.3 АНТИОКСИДАНТЫ И ИНГИБИТОРЫ

Антиоксидант - это любое вещество, которое, присутствуя в низких по сравнению с окисляемым субстратом концентрациях, существенно задерживает или ингибирует его окисление [10].
По химической природе биоантиокислители представляю собой широкий класс соединений: ферменты (СОД, каталаза ГПО), фенолы и полифенолы (токоферолы, эвгенол, конидендрин, пирокатехин, производные галловой кислоты), флавоноиды (рутин, кверцетин), стероидные гормоны (лецитин, кефалин) и многие другие соединения. В зависимости от растворимости различают жирорастворимые (витамины E, A, K, стерины, убихинон) и водорастворимые (витамины С, B6, PP, серотонин, SH-содержащие соединения) биоантиокислители [9], по молекулярной массе выделяют группу низкомолекулярных антиоксидантов (глутатион, аскорбат, β-каротин, α-токоферол, мочевая кислота) и высокомолекулярных, не способных проникать через биологические барьеры (ферритин, каталаза, пероксидазы и др.).
По принципу антиокислительного действия в биологических системах все антиоксиданты могут быть разделены на антиоксиданты косвенного (опосредованного) действия и антиоксиданты прямого (направленного) действия. Такое деление удобно при рассмотрении патологических процессов, сопровождающихся развитием окислительного стресса, в этом случае все соединения, повышающие синтез эндогенных антиоксидантов, нормализующие метаболические процессы и стабилизирующие клеточные структуры, могут быть отнесены к антиоксидантам косвенного действия. Естественно, что эффективность антиоксидантов косвенного действия проявляется только в живых системах. Соединения, непосредственного подавляющие окислительные процессы с участием АКМ invitroиinvivo можно рассматривать как антиоксиданты прямого действия. В зависимости от точки приложения действие антиоксиданта может осуществляться посредством одного или нескольких механизмов, при этом соединения, реализующие свой антиоксидантный эффект посредством механизмов II, III, V, VI, иногда называются превентивными антиоксидантами, в то время как пути Iи IV характерны для ингибиторов АКМ, действие которых в достаточной степени специфично.
По мере развития наших знаний об окислительных процессах с участием АКМ изменяется и представление об антиоксидантных механизмах защиты. До недавнего времени рассматривалась преимущественно патогенная функция АКМ, реализующаяся посредством активации процессов ПОЛ в биомембранах; при этом считалось, что как в норме, так и при патологических процессах необходимо ингибировать наработку АКМ и снижать активность ПОЛ. Исследования последних лет выявили участие АКМ в регуляции тонуса сосудов, клеточной пролиферации, синтеза простагландинов, в микробицидном действии фагоцитов, в регуляции метаболических процессов в качестве внутриклеточных мессенджеров. При этом поднимается вопрос о целесообразности в определённых ситуациях ингибирования наработки АКМ, что имеет важное практическое значение, так как с позиций существующих представлений сложно объяснить лечебный эффект введения перекиси водорода в низких концентрациях или аутотрансфузии УФ-облучённой крови. Применение антиоксидантных витаминов (Е, С) и β-каротина в целях профилактики заболеваний в последние годы также ставится под сомнение.
Необходимо отметить, что понятия "антиоксидант" и "антиоксидантная защита" имеют очень размытый характер; перефразируя Германа Мелвилла, подробная систематизация антиоксидантных соединений равносильна попытке классифицировать составляющие мирового хаоса. Так, антиоксидантами можно назвать все вещества, снижающие активность ферментативных реакций наработки АКМ (например, аллопуринол), а также многие противовоспалительные препараты, ингибирующие развитие метаболического "взрыва" в фагоцитирующих клетках. Иногда вводится понятие "вторичная антиоксидантная система", которым обозначают специализированные ферментативные механизмы устранения окислительных повреждений в клетках, такие протеиназы, фосфолипазы, экзо- и эндонуклеазы и др. Своевременное удаление повреждённых молекул повышает устойчивость клеток к токсическому действию АКМ, и поэтому с позиций биологической системы и биологической значимости радикальных окислительных процессов такие ферментативные системы могут рассматриваться как антиоксиданты.

2. СЕЛЕН В АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЕ

Общие сведения
Элементарный селен - это гомоцепной неорганический полимер с винтообразными макромолекулами, уложенными параллельно. В цепях атомы связаны ковалентно, а молекулы-цепи объединены молекулярными силами и частично - металлической связью. Селен и его соединения используются в различных областях деятельности, в том числе в медицине и в производстве БАД. В частности, селен признан одним из важнейших антиоксидантов; этот элемент способствует детоксикации производных кислорода в организме (свободных радикалов) и играет немаловажную роль в борьбе с раком.
Селен не может синтезироваться, а должен поступать с пищей извне. Следовательно, нет селена - нет глутатионпероксидазы. Нет глутатионпероксидазы - нет химической защиты от АКМ и организм быстро стареет, возникают мутации, повреждения белков и клеточных стенок.
Селен представляет собой компонент глутатионпероксидазы и является выраженным синергистом витаминов антиоксидантной группы. Этот микроэлемент - важная составная часть сбалансированного питания (в почвах Украины имеется его дефицит). Необходимые суточные добавки к пище селена составляют около 70 мкг для мужчин и 50 - для женщин (0,87 мкг/кг). В крови часть селена связывается с белками, концентрация его в тканях органов значительно различается. Об уровне селена в организме можно судить по активности глутатионпероксидазы, особенно это касается лиц с низким потреблением селена. Из организма селен удаляется в основном путем экскреции с мочой. Токсичность селена весьма низкая: клинические проявления наблюдаются при длительном приеме 1 мг/сут и более. Молекулярные механизмы развития токсичности неизвестны. От содержания селена в организме зависит функционирование цитохрома Р-450 в эндоплазматической сети клеток печени, а также транспорт электронов в митохондриях. Дефицит его в организме сопровождается развитием алиментарной мышечной дистрофии, эндемической селенодефицитной кардиомиопатии. Сниженное содержание этого микроэлемента обнаруживают у больных инфарктом миокарда, миокардиодистрофиями, дилатационной кардиомиопатией. Применение селена положительно влияет на процессы регенерации в сердечной мышце после перенесенного инфаркта миокарда. Он стимулирует иммуногенез и, в частности, продукцию антител, участвует как антиоксидант в окислительно-восстановительных процессах, дыхании клетки, синтезе специфических белков. Дефицит его у животных сопровождается фиброзом, дистрофическими процессами в поджелудочной железе, некрозами в печени, эозинофильным энтеритом, который протекает на фоне недостаточности витамина Е. У животных наблюдается задержка роста, развития, нарушается репродуктивная функция. Имеется отрицательная обратная корреляция между потреблением селена, его уровнем и смертностью от злокачественных заболеваний легких, молочной железы, кишечника, яичников. Он оказывает и непосредственное повреждающее действие на злокачественные клетки. Кроме антиканцерогенного действия селен имеет и антимутагенный эффект, противодействует токсическому влиянию тяжелых металлов (возможно за счет образования нерастворимых комплексов, восстановления дисульфидных связей в белках в SH-группы). Важнейшей ролью селена является его вхождение в состав глутатионпероксидазы - фермента предохраняющего клетки от токсического действия перекисных радикалов. Имеется связь между селеном и витамином Е - они влияют на разные этапы образования органических перекисей: токоферолы подавляют (предупреждают) перекисное окисление полиненасыщенных жирных кислот, а содержащая селен глутатионпероксидаза разрушает уже образовавшиеся перекиси липидов, перекись водорода. Глутатионпероксидаза, не содержащая селен, - глутатион-S-трансфераза - разрушает только перекись водорода (как и каталаза). При достаточном поступлении в организм витамина Е проявления дефицита селена значительно нивелируются. Наибольшее количество селена содержится в белках с высоким содержанием цистина: образуются трисульфиды, которые подобно сульфгидрильным группам мембранных белков, регулируют стабильность и проницаемость мембран. При дефиците селена и снижении активности глутатионпероксидазы повышается гемолиз эритроцитов вследствие действия перекиси водорода и липоперекисей. На активность глутатионпероксидазы влияет уровень содержания витаминов С и А, которые способствуют усвоению селена, его транспорту и утилизации. Селен также принимает участие в фотохимических реакциях, связанных с функцией зрения. Витамин Е предупреждает окисление селена, способствует его сохранению. Добавка селена при Е-дефицитном рационе тормозит накопление липоперекисей, ликвидирует или предупреждает симптомы Е-витаминной недостаточности. Восстановленныйглутатион и глутатионпероксидаза превращают липоперекиси в менее токсичные оксикислоты и этим предупреждают повреждение биоструктур. Пополнение фонда глутатиона происходит за счет аминокислот, которые содержат серу.
Глутатионпероксидаза
Для инактивации перекиси водорода в клетках высших животных существует одно важное семейство ферментов - глутатионпероксидаз (систематическое название "глутатион: перекись-водорода-оксидоредуктаза"), существование которого показано Гордоном Милзом в 1957 г. В 1973 г. Джон.Т. Ротрак с соавт. установили, что в состав ГПО входит селен, и каждая молекула фермента содержала 4 атома Se. Помимо это клеточной изоформы, получившей при дальнейшей классификации порядковый номер 1 (ГПО1), глутатионпероксидаза представлена селеновыми изоферментами - "желудочно-кишечным" (ГПО2, выделен из цитозоля клеток печени и кишечника), внеклеточным (ГПО3, выявляется в плазме и молоке), ГПО гидроперекисей фосфолипидов (ГПО4) и не содержащими Seизозимами-"секреторным" (ГПО5, обнаруживаемая в придатках яичек) и ГПО7, а также экзотический ГПО6, в состав которой селен либо входит (человек, свинья), либо не входит (мышь, крыса).
Рассмотрим селеносодержащие ГПО.
"Классическая" (или "цитозольная", "клеточная") ГПО1 представляет собой тетрамер, состоящий из четырёх идентичных сферических субъединиц; гидрофильность затрудняет её проникновение в липидный слой мембран; поэтому основная часть фермента (~70%) локализована в цитозоле, и около 20-30 % - в митохондриях всех клеток млекопитающих. Каждая субъединица содержит по 1 атому селена, входящему в состав селеноцистеиновых остатков; на тетрамере имеется 2 активных GSH-связывающих центра. Селеноцистеин обладает необычным свойством: кодирующий его кодон UGAимеет и вторую функцию - терминации синтеза белка, что зачастую приводит к ошибочным истолкованиям данного кодона; так, при расшифровке генома человека не был правильно предсказан ни один из 25 селенопротеинов. Уэукариот кодон UGAраспознаётся как сигнал для внедрения в белок селеноцистеина в том случае, если в 3’-нетранслируемом участке соответствующей ДНК содержится особая структура, называемая "Sec-внедряющая последовательность" (SECIS, Secinsertionsequence).
При недостатке селена в рационе питания уменьшается уровень ГПО, что снижает устойчивость организмов к окислительному стрессу и может приводить к развитию свободнорадикальной патологии, аналогичной авитаминозу Е и характеризующейся разрушением эритроцитов, некрозом и ожирением печени (беломышечная болезнь животных). У человека снижение активности ГПО1 в результате дефицита селена выявлено при сердечно-сосудистых заболеваниях, в том числе болезнях Кешана и Кашин-Бека; при раке; у детей с фенилкетонурией, из рациона питания которых исключён феналаланин, а также у больных фиброзом мочевого пузыря, длительное время находящихся на парентеральном питании. Данные эпидемиологических исследований демонстрируют наличие обратной корреляции между содержанием Seв питьевой воде и смертностью от сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Токсичность селена для человека проявляется при суточных дозах потребления >1 мг, при этом его концентрация в крови достигает 40 мкМ.
"Желудочно-кишечная" ГПО2 - тетрамерный цитоплазматический фермент, индетичный классической ГПО1 приблизительно на 65 % по аминокислотной последовательности и на 60 % - по нуклеотидной последовательности и имеющий такую же субстратную специфичность, то есть способен восстанавливать перекись водорода и гидроперекиси жирных кислот, но не гидроперекиси фосфолипидов. У крыс данная изоформа локализована главным образом в желудочно-кишечном тракте, в то время как у людей - в печени и толстом кишечнике.
Внеклеточная ("плазматическая") селен-содержащая ГПО3 представляет собой тетрамерный гликопротеин. ДНК изозима выявлена и секвенирована для многих видов животных, в том числе человека, крыс, мышей и быков; эти исследования показали, что по нуклеотидной последовательности внеклеточная ГПО3 на 40-50% идентична классической ГПО1. Изофермент содержится главным образом в почках, а именно - в проксимальных канальцах, однако синтезируется и другими клетками (мРНК ГПО3 экспрессируется в сердце, плаценте, лёгких, желудочно-кишечном тракте); наличие энзима в грудном молоке позволяет предположить, что он также синтезируется клетками молочных желез. До недавнего времени ГПО3 плазмы считались аномальным ферментом, так как её Kmдля GSHсоставляет несколько ммоль, в то время как физиологическая концентрация глутатиона в плазме человека не превышает 10мМ. Однако недавно было показано, что эффективными донорами электронов для внеклеточной ГПО является тиоредоксинредуктаза и тиоредоксин, в присутствии нано - и миллимолярных концентраций которых и НАДФН фермент эффективно восстанавливал гидроперекись трет-бутила; аналогичным действием обладал глутаредоксин в миллимолярных концентрациях, в то время как глутатион был неэффективен в концентрациях вплоть до физиологически достижимых. Внеклеточная ГПО3 играет важную роль в создании антиоксидантного барьера лёгких; более половины активности ГПО бронхоальвеолярной жидкости приходится на внеклеточный изофермент, секретируемый главным образом эпителиоцитами бронхов, альвеолярными макрофагами и интерстициальными клетками.
В 2003-м г. Георгием В. Крюковым с соавт. на основе компьютерного анализа генома идентифицирована ГПО6, имеющая на тесную гомологию с ГПО3; вычисленный белок имеет глобулярную структуру, содержит остаток селеноцистеина в положении 73 и обнаруживается только в эмбрионах и эпителии органов обоняния взрослых мышей. ГПО6 крыс ранее была клонирована как белок, метаболизирующийодоранты; ортологи фермента у крыс и мышей вместо остатка селеноцистеина содержат цистеин, в то время как изозим свиней представляет собой селенопротеин. Проведённым Г.В. Крюковым с соавт. анализ показал, что содержащийся в 3’-нетранслируемом участке гена, кодирующего ГПО6 мышей, элемент SECISявляется нефункциональным вследствие мутацийавторы заключили, что селеноцистеин, первоначально присутствующий в белках семейства глутатионпероксидаз у млекопитающих, у грызунов в ходе эволюции был заменён на цистеин. Все ГПО в большей или меньшей степени катализируют реакцию восстановления глутатионом нестойких органических гидропероксидов, включая гидропероксиды полиненасыщенных жирных кислот, в стабильные соединения - оксикислоты:

GSH + ROOH → GSSG + ROH + H2O

В результате взаимодействия с гидропероксидом ROOH селеноцистеиновый остаток фермента переходит из селенола в селененовую кислоту, с которой затем связывается GSHс образованием селененилсульфида:

ГПО-SeH + ROOH→ROH + ГПО-SeOH
ГПО-SeOH + GSH → H2O + ГПО-Se-SG

Прореагировав со второй молекулой глутатиона, ГПО возвращается в исходное состояние:

ГПО-Se-SG + GSH → ГПО-SeH + GSSG

Подобно каталазе, ГПО способны также утилизировать H2O2:

GSH + H2O2→GSSG + 2H2O

Кроме того, недавно обнаружено, что селеносодержащие ГПО проявляют пероксинитритредуктазную активность, восстанавливая ONOO¯до нитрит-анионаNO2¯и тем самым предотвращая опасные реакции окисления и нитрования, в которые активно вступает пероксинитрит. Стехиометрия пероксинитритредуктазной реакции аналогична классической глутатионпероксидазной реакции с участием гидропероксидов: взаимодействуя с ONOO¯, фермент окисляется до селеновой кислоты и затем восстанавливается до исходного состояния двумя молекулами глутатиона; скорость реакции составляет 8 × 106M-1c-1.
Также селеновые ГПО играют важную роль в регуляции биосинтеза эйкозаноидов, контролируя содержание органических перекисей и поддерживая так называемый "перекисный тонус". Так, циклооксигеназа, переводящаяарахидоновую кислоту в циклоэндогидроперекисьPGH2, активируется гидроперекисью, высокое содержание которой приводит к самоинактивации фермента. Обычная физиологическая концентрация гидроперекисей в клетках млекопитающих составляет около 10-10 М, и её повышение до 10-6 М вызывает активацию циклооксигеназы. Предпологается, что липоксигеназа, отвечающая за синтез лейкотриенов, простациклиновые и тромбоксановыесинтетазы, также являются объектами перекисной регуляции. С этой точки зрения становится ясно, насколько важна функция ГПО в патогенезе воспалительных процессов.
Представлялось целесообразным изучить поведение этих веществ в опытах in vitro, включающих более сложный объект - природные биологические мембраны.
Материалы и методы
. Исследование интенсивности индуцированного ПОЛ
. Определение концентрации белка по методу Бредфорда
В качестве подобного объекта мы использовали микросомы печени крыс - выделенные с помощью дифференциального центрифугирования мембраны эндоплазматического ретикулума, поскольку эта структура богата субстратами ПОЛ - моно - и полиненасыщенными жирными кислотами; в ее составе функционируют цепи переноса электронов, что создает условия для образования радикальных форм кислорода; многие ферменты микросом относятся к металлопротеинам, т.е. связаны с металлами переменной валентности, что также играет роль в активации ПОЛ. Использование микросом позволяет в определенной мере стандартизовать условия проведения опыта. Полученные результаты приведены в таблице 2. Постановка эксперимента была общепринятой [25] и заключалась в искусственном индуцировании перекисного окисления липидов мембран микросом с помощью аскорбиновой кислоты и ионов железа (соль Мора). Добавление этих компонентов в реакционную среду способствовало образованию активированных кислородных метаболитов (гидроксильных радикалов, пероксидных радикалов жирных кислот и т.д.). После инкубации в течение 20 минут в пробах спектрофотометрически определялось количество вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида. По уровню его накопления судили об антиоксидантной активности добавляемых в реакционную среду исследуемых веществ. Для сравнения использовали ионол. Контролем служили образцы без активных веществ, но с добавлением растворителя (ДМСО), который сам обладает некоторым антиоксидантным эффектом.
Как видно из приведенных данных, преимущественное большинство соединений, показавших в предыдущем опыте антиоксидантный эффект обнаруживало подобную активность и в более сложной системе. Однако были и исключения. В общем, подобное поведение антиоксидантов не является неожиданным. Известно, что усложнение системы, в которой проводятся испытания антиоксидантных свойств приводит иногда к снижению эффективности препарата [24]. (Именно этим фактом мы руководствовались, применяя в опыте концентрации веществ несколько более высокие, чем полученные для них величины IC50.) Более того, в исключительных случаях может изменяться сама направленность эффекта - с антиоксидантной до прооксидантной. Это связано с синергическим эффектом при взаимодействии нескольких слабых факторов в живом объекте, приводящим к их резкому усилению. Например, в клетке в определенных условиях может значительно возрастать энергия слабых радикальных соединений, их превращение в активаторов ПОЛ, тогда как в норме сами по себе они являются ингибиторами ПОЛ именно из-за своих радикальных свойств и не представляют опасности из-за низкой энергетичности. Это показано, в частности, в опытах с применением витамина Е [1]. Разумеется, в каждом подобном случае причины изменения эффектов одного и того же соединения в разных условиях опыта могут быть совершенно различны, но все они, безусловно, связаны с взаимодействием того или иного соединения с какими-то структурами в изучаемой системе.
Как и в первой серии опытов, соединения KDA-150, DVD-2521, KDA-132, BO-20, NAA-85, DVD-8843, DVD-2808, DVD-26 проявили антиоксидантную активность, причем, в данном случае - в присутствии микросом. Это говорит о том, что, как минимум, эти вещества могут быть ловушками свободнорадикальных форм кислорода. Следовательно, их можно отнести к истинным антиоксидантам. Остальные вещества не обнаружили антиоксидантного эффекта на микросомах, что, вероятно, можно объяснить следующим образом.
В нашем случае вещество Л-8 (№12) проявило при инкубировании с микросомами отчетливый прооксидантный эффект, т.е. активировало ПОЛ (более чем на 40 %), тогда как в опытах с лецитином это вещество ингибировало липопереокисление, по-видимому, за счет улавливания и инактивации свободнорадикальных форм кислорода. Принимая во внимание структуру данного соединения, можно сделать вывод, что Л-8 действительно может связывать свободнорадикальные формы кислорода. В растворе лецитина это вызывает их инактивацию, поэтому процесс ПОЛ ингибируется, причем с примерно одинаковой эффективностью при разных концентрациях вещества, т.е. лимитирующим фактором, вероятно, является концентрация радикалов в среде. Однако при наличии мембранного липидного бислоя гидрофобная и довольно громоздкая молекула Л-8 проникает вглубь мембраны, задерживаясь там вместе со связанными кислородными радикалами. При встраивании молекулы Л-8 структура мембраны становится более рыхлая, радикалы кислорода получают свободный доступ к ненасыщенным жирным кислотам мембранных фосфолипидов, т.е. к субстратам ПОЛ. Проще говоря, мы считаем, что Л-8 может не только связывать, но и транспортировать радикальные формы кислорода в липидный бислой, встраиваясь в него и механически дестабилизируя его. Однако, для доказательства этого предположения целесообразно было бы сравнить влияние Л-8 на ПОЛ в лецитиновых липосомах. В подобной постановке лецитин находился бы не просто в растворе, а в составе липидного бислоя, состоящего исключительно из молекул лецитина.
Аналогичные выводы можно сделать, анализируя поведения соединения DVD-0749. Следует отметить лишь, что его молекула по величине почти в 2 раза меньше Л-8, но также не является компактной молекулой. Вместе с тем, очень похожее визуально на DVD-0749 соединение DVD-4702 проявляет умеренно антиоксидантные свойства в обоих случаях - и в простой безмембранной системе с субстратом ПОЛ лецитином, и при наличии этого же компонента (наряду с другими) в составе мембран микросом. Очевидно, что структурные отличия являются причиной разного поведения этих соединений, однако на данном этапе исследований не представляется возможным объяснить, каким образом.

Таблица 2
Влияние новых синтетических гетероциклических соединений на индукцию аскорбат-зависимого ПОЛ в микросомах печени крыс, X±Sx; n=6
Названия препаратов Концентрация препаратов (мкМ) Концентрация МДА (нмоль на 1 мг белка за 1 мин) Ингибирование относительно контроля (%)
DVD-2521 2 2,5 1,05±0,009 52
10 1,74±0,011 20
KDA-150 10 2,5 1,82±0,010 17
10 1,67±0,008 26
KDA-132 11 2,5 1,23±0,011 44
10 1,31±0,015 40
BO-20 14 2,5 1,92±0,020 12
10 1,46±0,011 33
DVD-8843 1 10 1,38±0,009 37
-
DVD-2808 3 10 1,23±0,011 44
-
DVD-26 6 10 1,54±0,015 29
-
NAA-23 16 10 2,13±0,017 2
-
NAA-84 18 10 2,00±0,017 8
-
NAA-85 19 10 1,54±0,010 29
-
DVD-4702 8 10 2,15±0,021 1
25 2,26±0,015 0
DVD-0749 9 10 3,46±0,024 0
25 3,08±0,020 0
Л-8 12 10 3,08±0,029 0
25 2,46±0,021 0
BO-35 15 10 2,31±0,020 0
25 2,61±0,012 0
DVD-3779 4 25 2,22±0,011 0
-
DVD-69 5 25 2,00±0,015 8
-
Л-15 13 25 1,90±0,011 13
-
NAA-177 17 25 2,23±0,019 0
-
Контроль (с раство-рителем) - 2,18±0,015 0
Ионол 0,18±0,012 92

Соединения DVD-3779 и ВО-35 также, как и три вышеописанных, вероятно, являясь ловушками свободнорадикальных форм кислорода, вероятно, могут переносить их в липидный мембранный бислой с разной степенью эффективности и в зависимости от типа этого бислоя.
Отдельно следует сказать о соединениях, которые были растворимы в воде - NAA-23 и NAA-177. Они показали слабую антиоксидантную активность. Причем в случае с NAA-177 она не зависела от концентрации вещества в растворе с лецитином. В системе с микросомами препараты не функционировали как антиоксиданты. Вероятно, это связано с непроницаемостью для них липидного мембранного бислоя за счет их заряженности. Возможно, эти соединения могут проявить себя в другом биологическом качестве, например, они вполне могут действовать как нуклеофилы, участвуя в разобщении процессов дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях. Мы планируем проверить это предположение в следующих опытах.
Таким образом, из 18 исследуемых соединений 8 продемонстрировали выраженные антиоксидантные свойства, их IC50 оказался в области 2 мкМ. При концентрации 10 мкМ эти соединения показывали антиоксидантный эффект не только в модельной системе с субстратом ПОЛ лецитином, но и в среде с микросомами - биологическими липидными бислойными мембранами. Кроме того, возможно проявление и иных биологически свойств этих соединений - способности связываться с липидами мембранного бислоя, выступая в качестве мембранных зондов; влиять на процессы переноса электронов в дыхательных цепях микросом и митохондрий; влиять на активность антиоксидантных ферментов. Однако, все эти предположения требуют отдельных исследований.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меньщикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков, И.А. Бондарь, Н.Ф. Круговых, В.А. Труфакин. - М.: Фирма "Слово", 2006. - 556 с.
2. Green M.J., Hill H.A.O. Chemistry of dioxygen // Mehtods of Enzymology. - Vol.105. - N. Y.: Acad. Press, 1984. P.3-22.
. Bast A., Haenen G.R.M.M., Doelman C.J.A. Oxidants and antioxidants: State of the art // Am. J. Med. - 1991. - Vol.91, Suppl.3C. - P.2S-13S.
. Sinha B.K., Mimnough E.G. Free radicals and anticancer drug resistance oxygen free radicals in the mechanisms of drug cytotoxicity and resistance by certain tumours // Free Radic. Biol. Med. - 1990. - Vol.8. - P.567-581.
5. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. - М.: Медицина, 1989. - 356 с.
6. Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology // Pharmacol. Rev. - 1991. - Vol.43. - P.109-142.
. Harris M.L., Schiller H.J., Reilly P.M. P. et al. Free radicals and other reactive oxygen metabolites in inflammatory bowel disease: Cause, consequence or epiphenomenon // Pharmacol. Ther. - 1992. - Vol.53. - P.375-408.
8. Маеда Х., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке // Биохимия. - 1998. - Т.63, вып.7. - С.1007-1019.
. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск: Наука, 1989.344 с.
10. Cornwell D.G., Morisaki N. Fatty acid paradoxes in the control of cell proliferation: Prostaglandins, lipid peroxides, and cooxidation reactions // Free Radicals in Biology. - Vol.6. - 1984. - P.96-149.
11. Сидорик Е.П., Баглей Е.А., Данко М.И. Биохемилюминесценция клеток при опухолевом процессе. - Киев: Наукова думка, 1989. - 218 с.
12. Weitzman S.A., Gordon L.I. Inflammation and cancer; Role of phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis // Blood. - 1990. Vol.76. - P.655-663.
. Harman D. Free radical theory of aging // Mutat. Res. - 1992. - Vol.275. P.257-266.
. Landar A., Darley-Usmar V.M. Nitric oxide and cell signaling; modulation of redox tone and protein modification // Amino Acids. - 2003. - Vol.25. - P.313-321.
. Poli G., Leonarduzzi G., Chiarpotto E. Oxidative stress and cell signaling // Current Med. Chem. - 2004. - Vol.11. - P.1163-1182.
16. Скулачев В.П. Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода // Сорос. образоват. журн. - 2001. - №6. - С.910-912.
17. Simon H.-U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation // Immunol. Rev. - 2003. Vol. 193. - P.101-110.
18. Brookes P.S. Yoom Y., Robotham J.L. et al. Calcium, ATP, and ROS; a mitochondrial love-hate triangle // Am. J. Physiol. Cell. - 2004. - Vol.287. - P.817-833.
. Boonstra J.,Post J.A. Molecular events associated with reactive oxygen species and cell cycle progression in mammalian cells // Gene. 2004. Vol.337. P.1-13.
. Gregg D., de Carvalho D.D. Kovacic H. Integrins and coagulation: a role for the ROS/redox signaling? // Antioxid. Redox. Signal. - 2004. - Vol.6. - P.757-764.
. Esposito F., Ammendola R., Faraonio R. et al. Redox control of signal transduction, gene expression and cellular senescence // Neurochem. Res. 2004. - Vol.29. - P.617-628.
22. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. и др. Свободные радикаля в живых системах // ВИНИТИ, Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. 1991. - Т.29. - С.1-249.
. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкин Ю.О., Комаров О.С., Владимиров Ю.А. Оценка антиоксидантной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов // Лабораторное дело. - 1988. - №5. - С.59-62.
. Фенольные биоантиоксиданты / Н.К. Зенков, Н.В. Кандалинцева, В.З. Ланкин, Е.Б. Меньщикова и др. - Новосибирск: СО РАМН, 2003. - 328 с.
. Лемешко В.В. Система микросомального окисления при развитии старения организма // Биохимия - 1980. - Т.45, №11. - с. 1964-1969.
. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкин Ю.О. и др. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов. // Лабораторное дело. - 1988 - № 5. - С.59 - 62.
Похожие материалы:

Добавление комментария

Ваше Имя:
Ваш E-Mail:

Код:
Включите эту картинку для отображения кода безопасности
обновить, если не виден код
Введите код: